Isolation of the subpopulation of melanoma cells with characteristics progenitors cells and analysis of their properties “stems” and tumorigenics

Melanoma is one of the most aggressive tumors and its resistance to many current therapeutic modalities is a well known fact. It is plausible to conjecture that this resistance is intimately related to the presence of a subpopulation of tumor stem cells. Following this idea we develop an experimental model with melanoma lineages whose cells present properties of stem cells, used: EGF (Epidermal Growth Factor), bFGF ("basic factor Growth Factor), LIF (Leukemia Inhibitory Factor") and retinoic acid. These cells were originated by long-term cultures (over 8 months) under special medium. A process of dedifferentiation forming adherents and non-adherents spheres has been clearly identified; cells from those spheres express stem cell markers and plasticity to transdifferentiation into other cellular types (neural-like, melanocytic-like and fibroblastic-like) have been observed. In vivo experiments with these cells reveal increased malignancy with significant growth of tumoral mass and larger ulceration when compared with control tumors. Oxidative stress played an important role in the survival of these cells during long-term cultures; protecting of apoptosis, and promoting the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2. During in vivo experiments we also observed one case of spontaneous metastases to GI tract after 25 days of subcutaneous injection of melanoma tumor stem cells in mice. Based on these findings, we propose that melanoma lineages under special medium and after long-term cultures develop a subpopulation with more stable properties and characteristics of stem cells with direct consequences to malignancy.O melanoma é o câncer de pele existente mais agressivo e sua resistência para muitas modalidades terapêuticas é conhecida. É plausível a conjectura de que a resistência deste tumor esteja intimamente relacionada à presença de uma subpopulação de células progenitoras tumorais. Com base nesta informação nosso trabalho propôs isolar células de linhagens de melanoma murino que apresentassem propriedades de células-tronco, para melhor caracterizá-las. Para tal utilizou-se um meio de cultura específico, contendo: Fator de Crescimento Epidermal (EGF), Fator de Crescimento Fibroblástico básico (bFGF), Fator Inibitório leucêmico (LIF) e Ácido Retinóico (AR). Estas células aparecem nas culturas de longo tempo (mais de 8 meses) e formam esferas aderentes e não aderentes onde parte destas esferas expressam marcadores de células-tronco e apresentam plasticidade para transdiferenciação em outros tipos celulares (neural-like, melanócito-like e fibroblasto-like). In vivo experimentos com estas esferas revelaram aumento da malignidade com crescimento significativo da massa tumoral e maior ulceração quando comparado com os tumores controle. O estresse oxidativo desempenhou uma importante função na sobrevivência destas células durante culturas de longo tempo; promovendo o aumento da expressão da proteína anti-apoptótica Bcl-2. Ainda durante os experimentos in vivo nós observamos um caso isolado de metástase espontânea para o intestino, após 25 dias da injeção subcutânea de células progenitoras de melanoma. Com base nestes achados, nós propomos que linhagens de melanoma sobre meio específico e após culturas de longo tempo compreendem um protocolo que isola uma subpopulação com características e propriedades predominantes de célulastronco fornecendo resultados significativos que podem contribuir para a melhor compreensão desta malignidade.TED